Особенности фармакологии ботулотоксина: почему эффект длится около 3 месяцев (часть 2)?

Так почему же эффект от введения ботулотоксина типа А (БТА) держится около 3 мес.?
Явно не потому, что так много времени необходимо для синтеза нового SNAP25 взамен инактивированного, ведь, по экспериментальным данным, цикл обновления SNAP25 длится всего около 5 дней. Ещё в далеком 1993 г. в монографии Botulinum and Tetanus Neurotoxins под редакцией Bibhuti R. DasGupta были приведены данные об изменениях в синапсе после функциональной денервации мышцы БТА (в т. ч. на примере фрагментов круговой мышцы глаза человека, полученных от пациентов, получавших БТА, которым была проведена блефаропластика).
Спраутинг (именно так произносится слово «sprouting» на английском языке, а не как мы часто встречаем в русской речи «спрутинг»), т. е. образование новых выростов аксона, контактирующих с мышцей, начинается уже спустя 2 дня после введения БТА. Множественные немиелинизированные коллатеральные выросты пресинаптической терминали и выросты из претерминальных перехватов Ранвье в итоге образуют новый синапс с концевой пластинкой на прилежащем мышечном волокне. Спустя 28–35 дней после инъекции БТА около 5–7 % сформировавшихся коллатералей миелинизируются. А когда ещё через пару месяцев (почему так долго, см. ниже) изначально инактивированные терминали восстанавливают свою функциональную активность, новые выросты (спрауты) и концевые пластинки регрессируют. Таким образом, в основе возобновления нервно-мышечной передачи лежит преимущественно восстановление ранее инактивированных терминалей.
Напомним, что, чтобы попасть внутрь нейрона, молекула нейротоксина связывается своей тяжёлой цепью с мембраной — этот процесс занимает около 30 мин. Затем происходит захват и интернализация ботулотоксина. Этот процесс не зависит от кальция, но частично зависит от стимуляции нерва. Тем не менее наиболее вероятно, что дополнительная электростимуляция после введения не повышает эффективность, т. к. введённого содержания препарата будет всё равно достаточно для оказания своего действия — БТА сверхвысокоактивен: 2 его молекулы способны вывести из строя весь синаптический аппарат одного синапса (подробнее см. ниже).
Интересно, что, согласно опубликованным в 2016 г. рекомендациям Американской академии неврологии (Practice guideline update summary: Botulinum neurotoxin for the treatment of blepharospasm, cervical dystonia, adult spasticity, and headache), введение в область, наиболее близкую к концевой пластинке, способствует оптимизации ответа на БТА, в то время как доказательство того, что электрическая стимуляция мышцы после введения в неё БТА повышает эффективность процедуры, в настоящее время не получено (согласно данным двойного слепого плацебоконтролируемого исследования). Вероятно, это отражает факт высокой активности БТА даже в малых дозах, что наиболее очевидно при целевом попадании нейротоксина в область концевых пластинок, и по этой причине дополнительная стимуляция не будет повышать эффективность.
Считается, что при захвате нейроном бо́льшая часть БТА попадает в кислые везикулы, что ведёт к стремительной транслокации нейротоксина в цитозоль, в то время как меньшая часть токсина попадает в некислые везикулярные компартменты и по микротрубочкам подвергается обратному аксональному транспорту. Одной из важных черт, объясняющих длительное сохранение терапевтического эффекта после введения, является способность протеазной части БТА избегать внутриклеточной деградации и сохраняться в клетке в течение длительного периода времени. Это кардинально отличает БТА, к примеру, от ботулотоксина типа Е, который довольно быстро разрушается протеасомами цитозоля, имея из-за этого период внутриклеточной полужизни лёгкой цепи всего около 1–2 дней.
Если ботулотоксин типа Е распределяется в цитозоле равномерно, то лёгкая цепь БТА концентрируется на внутренней стороне плазматической мембраны, что, очевидно, связано с двойным лейциновым мотивом протеазной части БТА. Такая локализация и позволяет избежать протеасомной деградации внутри клетки.
Кроме того, БТА взаимодействует с септинами — небольшими ГТФазными белками, которые полимеризуются в неполярные филаменты и участвуют в формировании цитоскелета. Другим возможным объяснением того, что БТА избегает убиквитин-протеасомной деградации, является рекрутирование им специализированных ферментов, которые удаляют полиубиквитиновые цепочки. Интересно, что в нейрональных культурах ферментная активность БТА сохраняется в течение года, а в центральных нейронах in vivo — в течение 5 мес. Для сравнения: функциональное восстановление нервно-мышечного синапса и длительность антиноцицептивной активности БТА у людей короче — 3–4 мес. При этом продолжительность периферического пареза мышцы зависит от дозы, т. е. более высокая доза приводит к более масштабному внутриклеточному накоплению активных протеаз БТА.
Ранее предполагалось, что одной из основных причин длительного эффекта от введения БТА является пресинаптическая персистенция неактивного гетеротримера SNARE. Однако впоследствии было показано, что при блокировании протеолитической активности внутриклеточного БТА при помощи электропорированных антител синаптическое высвобождение нейротрансмиттеров возобновлялось спустя 4–5 дней. Этот срок сопоставим со временем, необходимым для обновления синаптического SNAP-25.
Сверхвысокая активность БТА даже в малых дозах имеет довольно простое объяснение. Лёгкая цепь БТА благодаря цинкзависимой металлопротеазной активности отщепляет от белка SNAP25 9 аминокислот с С-конца . При этом, что интересно, усечённый вариант SNAP25 (1-197) не подвергается немедленному разрушению и не препятствует образованию гетеротримера SNARE, но при этом последний утрачивает свою физиологическую активность. Более того, нефункциональные комплексы SNARE конкурируют с нормальными комплексами за связывание с везикулами, содержащими нейромедиаторы. Помимо этого, для высвобождения содержимого везикул гетеротримеры SNARE формируют радиальные суперкомплексы; наличие всего лишь 1–2 усечённых молекул SNAP25 нарушает образование таких суперкомплексов. Таким образом, даже 1–2 молекулы БТА могут вывести из строя весь синаптический аппарат одного синапса. Ботулотоксинам типа В и Е, например, требуется бо́льшая доза для достижения такого же эффекта, т. к. их протеазная часть приводит к формированию остатка SNAP25, который сразу нарушает образование комплекса SNARE.
Блокирование высвобождения нейротрансмиттеров приводит к скоплению синаптических пузырьков около пресинаптической мембраны. По всей вероятности, БТА наиболее сильно блокирует высвобождение ацетилхолина и в меньшей степени других нейромедиаторов, таких как глутамат, норадреналин, серотонин, субстанция Р, кальцитонин ген-родственный пептид (CGRP), аденозинтрифосфат (АТФ), никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и др., что может зависеть от уровня экспрессии высокоаффинных белковых акцепторов на нейрональной мембране. SNARE-опосредованное высвобождение везикул требует кальцийрегулируемого сигнала — он приводит к конформационным изменениям и слиянию везикулярной мембраны с пресинаптической плазматической мембраной. Это обеспечивается взаимодействием везикулярного чувствительного к кальцию белка синаптотагмина с С-концом SNAP25. В обычных физиологических условиях отщепление БТА от SNAP25 9 аминокислотных остатков с С-конца приводит к снижению аффинности синаптотагмина к SNAP25 и нарушению их взаимодействия. Однако, как указано в книге Cellular and Molecular Neurophysiology (автор Constance Hammond, 4-е издание от 2015 г.), при высоких концентрациях внеклеточного кальция или при добавлении тетраэтиламмония хлорида либо 3,4-диаминопиридина, которые потенцируют вход кальция в клетку, взаимодействие усечённого SNAP25 и синаптотагмина восстанавливается, и комплекс SNARE вновь приобретает свою нормальную нейросекреторную функцию. К сожалению, данный факт невозможно использовать в клинической практике, т. к. физиологическая норма кальция в сыворотке колеблется в довольно узких границах (2,10–2,55 ммоль/л), и даже небольшое повышение его содержания может дать крайне негативные последствия.
Не только БТА действует на SNAP25, но также и ботулотоксин типов С и Е. Кроме того, ботулотоксин типа С расщепляет синтаксин-1а, имея таким образом не одну, а две молекулярные мишени. Ботулотоксины серотипов B, D, F и G разрушают другой белок комплекса SNARE — синаптобревин.
Ещё одной интересной особенностью БТА является то, что после введения он переходит преимущественно в гиперактивные нейроны. Это связано с тем, что гиперактивные нейроны экспрессируют в большем объёме гликозилированный белок SV2C, с которым связывается тяжёлая цепь БТА, обеспечивая захват нейротоксина нейроном.
Автор Юрий Селивёрстов
Читать в источнике...