Алгоритм диагностики аутосомно-рецессивных атаксий
М.: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2019;119(9):74-82. https://doi.org/10.17116/jnevro201911909174
Аутосомно-рецессивные атаксии (АРА) являются крайне обширной и гетерогенной группой прогрессирующих наследственных заболеваний, характеризующихся дегенерацией или нарушением развития мозжечка, поражением спинного мозга и/или периферической нервной системы, аутосомно-рецессивным типом наследования и, в большинстве случаев, дебютом в детском или молодом возрасте [1]. Помимо неврологической симптоматики для данной группы заболеваний характерно частое поражение других органов (сердце, поджелудочная железа, глаза, кожа, иммунная система и др.).
АРА включают в себя более 60 различных нозологических форм и отличаются широким полиморфизмом клинических проявлений: в отношении возраста дебюта, темпа прогрессирования, спектра неврологических и экстраневральных проявлений. Один и тот же фенотип может встречаться при различных заболеваниях, например при болезни Фридрейха и атаксии с дефицитом витамина Е. С другой стороны, мутации в одних и тех же генах могут приводить к различным фенотипам заболевания с несхожей клинической картиной (дебют болезни Фридрейха в детском и пожилом возрасте, наличие атипичных форм с сохранными глубокими рефлексами, спастичностью, атрофией зрительных нервов) [2, 3]. Таким образом, учитывая широкую фенотипическую и генетическую гетерогенность данной группы заболеваний, молекулярная диагностика остается крайне затруднительной.
До настоящего времени ДНК-диагностика АРА состояла в последовательном анализе генов, выбранных на основании клинической картины и параклинических обследований, методом стандартного сенгеровского секвенирования. Такой подход занимает длительное время и является достаточно трудоемким. В последние годы ситуация с молекулярным анализом сложных групп заболеваний значительно изменилась в связи с появлением новейших высокопроизводительных молекулярно-генетических технологий и в первую очередь массового параллельного секвенирования (англ.: Massive Parallel Sequencing, MPS). MPS позволяет за один рабочий цикл генерировать миллиарды нуклеотидных последовательностей, что обеспечивает параллельный анализ сотен выбранных генов или даже тотальное секвенирование всего генома [4]. Известны три основных стратегии применения технологии MPS на практике: полногеномное, полноэкзомное и панельное секвенирование. Из них панельное секвенирование представляет наибольший интерес для клинической практики, так как позволяет проводить целевое исследование генома в пределах интересующих локусов, ассоциированных с определенными фенотипами. Панели для MPS-анализа могут включать от 15—20 до нескольких сотен генов. Как было показано, применение панельного секвенирования при скрининге диагностически неясных случаев может выявлять мутации в различных генах более чем в 25—30% случаев [5]. В последние годы появились единичные работы, обсуждающие клинические преимущества панельного секвенирования при наследственных атаксиях [6—8]. В выборках российских пациентов с АРА подобные исследования не проводились.
Трудности дифференциальной диагностики АРА также связаны с большим количеством спорадических случаев заболевания, которые не противоречат аутосомно-рецессивному типу наследования ввиду малого количества сибсов в современных семьях. В таких случаях возникает необходимость исключать ненаследственные формы мозжечковых атаксий (мультисистемная атрофия мозжечкового типа — МСА-М, аутоиммунные, инфекционные, токсические и другие причины) [9]. Кроме того, широко известны спорадические случаи аутосомно-доминантных спиноцеребеллярных атаксий (АД СЦА), в том числе обусловленные экспансией микросателлитных повторов, выявление которых требует проведения соответствующих генетических исследований.
Таким образом, целью данной работы стала разработка комплексного алгоритма диагностики АРА, применимого для выборки российских пациентов с дегенеративными атаксиями.
Материал и методы
За 2016—2018 гг. в ФГБНУ НЦН были обследованы 48 пациентов (22 мужчины, 26 женщин, медиана возраста — 31 [26; 39] год; медиана возраста дебюта — 22 [13,5; 31,5] года) из 46 семей с семейными случаями мозжечковой атаксии с аутосомно-рецессивным типом наследования и спорадическими формами атаксий предположительно нейродегенеративного генеза. Критериями включения в исследование являлись возраст старше 18 лет, дебют заболевания до 50 лет, прогрессирование атаксии в течение более 1 года.
Работа выполнена в несколько этапов. На первом этапе проводили подробное исследование неврологического и соматического статуса. Выраженность атаксии оценивали с использованием шкалы для обследования и оценки атаксии (англ.: Scale for the Assessment and Rating of Ataxia, SARA) и Международной объединенной шкалы оценки атаксии (англ.: International Cooperative Ataxia Rating Scale, ICARS), а для скрининга когнитивных нарушений применяли Монреальскую шкалу оценки когнитивных функций (MoCA). Из инструментальных методов выполняли МРТ головного мозга в стандартных режимах (T1-ВИ, Т2-ВИ, Т2-FLAIR и DWI), стимуляционную электронейромиографию (ЭНМГ) и по показаниям — игольчатую электромиографию (ЭМГ). При необходимости проводили также комплекс обследований, позволяющих выявить приобретенные формы мозжечковых атаксий: глютеновую атаксию (антитела к дезаминированным пептидам глиадина и тканевой трансглутаминазе (IgA, IgG)), атаксию, ассоциированную с антителами к глутаматдекарбоксилазе (анти-GAD), паранеопластическую дегенерацию мозжечка (антинейрональные антитела (лайн-блот): Hu (ANNA 1), Yo-1 (PCA1), CV2, Ма2, Ri (ANNA2), амфифизин), гормоны и антитела к антигенам щитовидной железы, люмбальную пункцию с последующим анализом цереброспинальной жидкости (цитоз, белок, глюкоза, серологические реакции на нейроинфекции, иммунохимическое исследование). Диагностику мультисистемной атрофии проводили согласно критериям S. Gilman и соавт. [10]. Диагноз алкогольной мозжечковой дегенерации устанавливали на основании данных анамнеза злоупотребления алкоголем, характерной клинической картины и данных нейровизуализации.
На втором этапе проводили ДНК-диагностику наиболее распространенных АД СЦА, развитие которых связано с экспансией микросателлитных повторов (СЦА 1, 2, 3, 6 и 17-го типа). Образцы геномной ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с помощью набора для выделения Wizard Genomic DNA Purification Kit («Promega», США). Генотипирование тринуклеотидных повторов генов ATXN1, ATXN2, ATXN3, CACNA1A и TBP проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим фрагментным анализом. При выявлении патологической экспансии для определения точного количества повторов и наличия вставок осуществляли секвенирование данного участка методом Сенгера.
На третьем этапе проводили поиск экспансии GAA-повторов в 1-м интроне гена FXN, приводящей в гомозиготном состоянии к развитию болезни Фридрейха методом ПЦР с последующим разделением ампликонов в агарозном геле. Величину экспансии более 60 считали патологической.
На четвертом этапе была сформирована условная группа АРА (за исключением пациентов с болезнью Фридрейха, выявленных на предыдущем этапе). Пациентам данной группы проводили расширенное лабораторно-инструментальное обследование для уточнения возможной нозологической формы: анализы крови на витамин Е, альфа-фетопротеин, иммуноглобулины (IgG, IgM, IgA), креатинфосфокиназу, лактат и пируват, альбумин, холестерин, скрининг на болезнь Ниманна—Пика типа С (концентрация триола, 7-кетохолестерина и активность хитотриозидазы), УЗИ органов брюшной полости. В отдельных случаях, при наличии соответствующей клинической картины, исследовали содержание фитановой кислоты, меди и церулоплазмина крови, проводили энзимодиагностику болезни Гоше (определение активности глюкоцереброзидазы) и GM2-ганглиозидозов (общая активность гексозаминидазы и гексозаминидазы А). В дальнейшем пациентам данной группы было проведено исследование с использованием таргетной мультигенной MPS-панели на платформе Illumina MiSeq (США), как было описано ранее [11]. Данная панель направлена на секвенирование кодирующей области 300 генов наиболее значимых нейродегенеративных заболеваний, в том числе 136 генов, мутации в которых приводят к развитию наследственных атаксий. Все положительные находки подтверждались методом прямого секвенирования по Сенгеру на генетическом анализаторе НАНОФОР 05 (Санкт-Петербург). Часть исследований (4 пациента) была проведена в лаборатории «Геномед» c использованием мультигенной панели «Нейродегенеративные заболевания».
Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ НЦН. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в данном исследовании.
Статистический анализ осуществляли с помощью программы IBM SPSS Statistics 23 с использованием непараметрических методов статистики. Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха.
Результаты
На первом этапе обследования было выявлено 8 (16,7%) пациентов с приобретенными причинами мозжечковой атаксии (7 мужчин, 1 женщина, возраст 43,5 [38; 45,5] года; дебют 40 [35; 43,5] лет). Из них 6 пациентам установлен диагноз алкогольной мозжечковой дегенерации: у этих пациентов в клинической картине превалировали атаксия при ходьбе и при выполнении пяточно-коленной пробы, негрубая мозжечковая дизартрия в сочетании с другими признаками токсического поражения нервной системы (полинейропатия, проксимальная миопатия, когнитивные нарушения от умеренных до деменции). По данным МРТ головного мозга выявлены атрофические изменения преимущественно ростральных отделов червя мозжечка, у 5 пациентов — диффузная атрофия больших полушарий мозга. У 2 из 8 пациентов установлен диагноз МСА-М: в этих случаях клиническая картина была представлена сочетанием статико-локомоторной атаксии, легкого паркинсонизма, пирамидного синдрома, нарушений в REM-фазу сна и выраженных вегетативных нарушений (ортостатическая гипотензия, нейрогенный мочевой пузырь, импотенция). Необходимо отметить, что у всех указанных пациентов направительными диагнозами были «спиноцеребеллярная атаксия» или «мозжечковая дегенерация». Аутоиммунных причин развития атаксии выявлено не было.
На втором этапе в результате скрининга на носительство экспансии в генах СЦА 1, 2, 3, 6 и 17-го типа были выявлены 3 (6%) пациента со спорадической формой заболевания (табл. 1).
В результате выполнения предыдущих этапов из исходных 48 пациентов условную группу АРА сформировали 37 пациентов. Среди них 33 (89%) случая были спорадическим, а у 4 (11%) пациентов наблюдали аутосомно-рецессивный тип наследования (по 2 больных сибса в 2 семьях). Детский возраст дебюта (до 18 лет) отмечен у 13 (35%) пациентов. Фенотип «чистой атаксии» отмечен у 11% пациентов, в остальных случаях были выявлены дополнительные неврологические симптомы и синдромы: пирамидный синдром (54%), полинейропатия (54%), когнитивные нарушения (51%), поражение задних столбов спинного мозга (32%), широкий спектр глазодвигательных нарушений (27%), включая наружный офтальмопарез, нистагм, окуломоторную апраксию, нарушение плавности следящих движений глазных яблок, гипо-/гиперметрию и замедление саккад. Тазовые расстройства выявлены у 8% пациентов, симптомы поражения лобных долей — у 5%, эписиндром — у 5%. Нередкими были двигательные расстройства: дистония — 22%, хорея — 5,4%, миоклонус — 3%, паркинсонизм — 3%. При проведении МРТ головного мозга в большинстве случаев были выявлены признаки атрофии червя и полушарий мозжечка (54%), а также изолированная атрофия червя (8%) и оливопонтоцеребеллярная атрофия (8%). В 14% случаев атрофические изменения мозжечка сочетались с диффузной атрофией больших полушарий головного мозга, в 27% — с атрофией спинного мозга (преимущественно у пациентов с болезнью Фридрейха), у 24% пациентов МРТ головного мозга соответствовала норме. При проведении стимуляционной ЭНМГ выявлена сенсорная аксональная (32%), сенсомоторная аксональная (8%), сенсомоторная аксонально-демиелинизирующая полинейропатия (14%), в 46% случаев патологии не выявлено. По данным игольчатой ЭМГ признаки поражения нижних мотонейронов на нескольких уровнях были обнаружены у 3 пациентов (всем были исключены GM2-ганглиозидозы методом энзимодиагностики).
На третьем этапе были выявлены 9 пациентов из 8 семей с болезнью Фридрейха (18,8%) — все были гомозиготными носителями патологической GAA-экспансии в гене FXN (4 мужчин, 5 женщин, возраст 28 [27; 33] лет; дебют 10 [7; 22] лет). У 4 пациентов заболевание дебютировало в возрасте 21—24 лет, что, однако, не позволяет диагностировать атипичную форму болезни Фридрейха с поздним началом (late-onset Friedreich ataxia, LOFA). Медиана длительности заболевания составила 6 [5; 9] лет. Клиническая картина у большинства выявленных пациентов с болезнью Фридрейха была типичной: атаксия смешанного характера (сенситивная, мозжечковая), снижение или отсутствие глубоких рефлексов, вялые парезы различной степени выраженности (больше в ногах), рефлекс Бабинского, вестибулярный синдром стволового уровня, снижение вибрационной и проприоцептивной чувствительности (преимущественно в ногах). Лишь у 1 пациента отмечена атипичная форма — с сохранными глубокими рефлексами (Freidreich ataxia with retained reflexes, FARR). Медиана оценки по шкалам тяжести атаксии составила: SARA 22/40 [9; 29] баллов, ICARS 62/100 [28; 69] баллов, по шкале MоCA 25 [22; 27] баллов. На момент обследования 5 пациентов самостоятельно не передвигались и использовали инвалидное кресло. При проведении ЭНМГ у всех пациентов выявлена сенсорная аксональная полинейропатия. Экстраневральные проявления были представлены эквиноварусными деформациями стоп (6/9), сколиозом (7/9), признаками кардиомиопатии с гипертрофией левого желудочка, фиброзом миокарда, нарушениями ритма и проводимости (4/9), нарушениями углеводного обмена (2/9).
Наконец, на четвертом этапе комплексное лабораторно-инструментальное обследование (в том числе с использованием таргетной мультигенной MPS-панели) было выполнено 28 пациентам (10 мужчин и 18 женщин, медиана возраста 28 [23; 37,5] лет; медиана дебюта 19,5 [13,5; 29] года), при этом молекулярный диагноз был установлен 8 (28,6%) пациентам из 7 семей. У всех этих пациентов выявлены по 2 мутации в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии (всего 14 мутаций). Согласно «Руководству по интерпретации данных, полученных методами MPS» [12], 4 выявленные мутации являются описанными ранее в литературе и признаны патогенными, остальные по программам предсказания патогенности SIFT, PolyPhen2 hdiv и Mutation Tester расценены как вероятно патогенные либо как варианты с неопределенной клинической значимостью. Большую роль в выборе каузальных мутаций играло тщательное сопоставление с фенотипом заболевания (табл. 2).
У 3 пациентов из 2 неродственных семей был установлен диагноз атаксии-телеангиэктазии. Клиническая картина являлась достаточно типичной (детский возраст дебюта, прогрессирующая атаксия, полинейропатия, дистония, повышение уровня альфа-фетопротеина в крови, В-клеточный лейкоз у одной из пациенток), однако особенностью данных случаев явилось отсутствие телеангиэктазий на коже, слизистых оболочках и конъюнктиве глаз, а также отсутствие анамнестических сведений о частых инфекционных заболеваниях, что, вероятно, затрудняло своевременную постановку диагноза. Впервые в выборке российских пациентов описан пациент с аутосомно-рецессивной СЦА 16-го типа (SCAR16) с типичной клинической картиной — медленно прогрессирующая статико-локомоторная атаксия в сочетании с сенсорной аксональной полинейропатией и дебютом заболевания в молодом возрасте. Также впервые нами выявлена пациентка с аутосомно-рецессивной СЦА 10-го типа (SCAR10) — одной из частых форм АРА, по данным зарубежной литературы. Кроме того, нами был выявлен пациент с редким фенотипом — атипичным вариантом нейроаксональной дистрофии (нейродегенерация с накоплением железа в головном мозге 2В-типа), обусловленным компаунд-гетерозиготным носительством мутаций в гене PLA2G6. Особенностью данного случая явился дебют заболевания в детском возрасте с прогрессирующей атаксии и деформаций стоп по типу «полой», в связи с чем пациент несколько лет наблюдался с диагнозом «атаксия Фридрейха». При МРТ головного мозга в стандартных режимах не были выявлены признаки накопления железа в базальных ядрах, что, однако, не исключает диагноз нейродегенерации с накоплением железа в мозге и требует использования более чувствительных импульсных последовательностей. У пациентов с синдромом SANDO и атаксией с окуломоторной апраксией 2-го типа наблюдали типичную клиническую картину (табл. 2). Примеры МРТ головного мозга пациентов представлены на рисунке.
Обсуждение
Трудности в диагностике АРА связаны, прежде всего, с их клиническим полиморфизмом и наличием перекрывающихся с различными ненаследственными атаксиями фенотипов. Согласно рекомендациям EFNS/ENS по диагностике хронических атаксий, в любом случае выявления спорадической атаксии целесообразно проведение поиска приобретенных курабельных причин атаксии (глютеновой, ассоциированной с антителами к GAD и др.) [9]. Также на начальном этапе у пациентов с дебютом атаксии старше 30 лет и выраженными вегетативными нарушениями необходимо исключить МСА-М, что может позволить избежать дальнейших обследований. Однако, по нашим данным, данный пункт не является однозначным: так, у пациентки со спорадической атаксией, дебютировавшей в 35 лет, с тазовыми нарушениями и картиной оливопонтоцеребеллярной атрофии при МРТ головного мозга, наличие грубого замедления горизонтальных и вертикальных саккад побудило нас направить ее на дальнейшую ДНК-диагностику, которая выявила СЦА 2-го типа. Данный пример оправдывает необходимость дальнейшей генетической верификации у пациентов с диагнозом МСА-М при выявлении симптомов, настораживающих в отношении клинически схожих заболеваний.
АД СЦА, обусловленные экспансией микросателлитных повторов, также могут быть выявлены среди пациентов со спорадическими формами атаксий, особенно с дебютом во взрослом возрасте. Положительный семейный анамнез может не выявляться вследствие генерации новой мутации из премутации (с промежуточной длиной экспансии), смерти родственников до дебюта заболевания или ложного отцовства/материнства. Согласно литературным данным у 2—22% пациентов со спорадическими формами атаксии с дебютом во взрослом возрасте выявляется патологическая экспансия в одном из генов СЦА, наиболее часто — в гене CACNA1A (СЦА 6-го типа) [13—16]. В нашем исследовании спорадические формы АД СЦА составили 6%, поэтому перед проведением MPS можно рекомендовать ДНК-диагностику наиболее частых АД СЦА, обусловленных экспансией микросателлитных повторов, что связано как с ограничением метода MPS в выявлении экспансий, так и с меньшей стоимостью метода фрагментного анализа.
В настоящий момент наиболее изученным заболеванием среди АРА является болезнь Фридрейха. Остальные более редкие формы АРА освещены в немногочисленных отечественных публикациях как описания единичных клинических случаев, в частности наблюдения атаксии с окуломоторной апраксией 1, 2 и 4-го типа, атаксии-телеангиэктазии и митохондриальных атаксий [17—22]. Необходимо отметить, что, по данным зарубежной литературы, частично определен нозологический спектр АРА для некоторых популяций [6, 8, 23]. По данным этих исследователей, наиболее частыми формами являются болезнь Фридрейха, атаксия с дефицитом витамина Е, атаксия-телеангиэктазия, атаксия с окуломоторной апраксией 1-го и 2-го типа, спастическая атаксия Шарлевуа—Сагене, реже встречаются атаксии, ассоциированные с мутациями в генах SPG7, ADCK3, SYNE1, ANO10.
В нашем исследовании также подтверждена высокая частота встречаемости болезни Фридрейха (18,8%). Кроме того, выявлены 2 пациента с мутациями в гене POLG и фенотипом синдрома SANDO. Эти данные указывают на высокую суммарную частоту митохондриальных атаксий в выборке российских пациентов с АРА. Не были обнаружены такие частые формы (по данным зарубежной литературы), как спастическая атаксия Шарлевуа—Сагене и атаксия с дефицитом витамина Е, что, вероятнее всего, связано с генетическими особенностями российской популяции. Кроме того, большинство пациентов с атаксией Шарлевуа—Сагене ввиду раннего дебюта и характерного фенотипа часто наблюдаются с диагнозами «детский церебральный паралич» и «рассеянный склероз, спинальная форма» и редко попадают в поле зрения нейрогенетиков.
Необходимо отметить, что использование дополнительных методов обследования (ЭНМГ, биохимические маркеры — альфа-фетопротеин, лактат, витамин Е в сыворотке крови и др.) значительно облегчают постановку диагноза еще на этапе, предшествующем применению MPS-панели. Так, например, сочетание полинейропатии с повышенным уровнем альфа-фетопротеина и нормальными значениями уровней альбумина и холестерина в крови в большей степени указывают на наличие одного из двух заболеваний — атаксии-телеангиэктазии или атаксии с окуломоторной апраксией 2-го типа. Таким образом, всестороннее обследование пациентов перед проведением MPS-анализа является целесообразным и в дальнейшем значительно облегчает поиск каузальных мутаций. В нашей работе в результате использования технологии MPS молекулярный диагноз был установлен в 28,6% случаев, что соответствует мировым данным [7, 24, 25]. Пошаговое классическое секвенирование генов-кандидатов для диагностики конкретной формы АРА нерационально ввиду большого числа экзонов в ряде генов атаксий и широкого фенотипического перекрытия, поэтому использование таргетных MPS-панелей является предпочтительным.
Заключение
В случае выявления пациента с хронической атаксией (спорадические и аутосомно-рецессивные случаи) следует использовать унифицированный алгоритм дифференциальной диагностики. На первом этапе необходимо исключить приобретенные причины атаксии и МСА-М. На следующем этапе целесообразно проводить ДНК-диагностику частых форм наследственных атаксий, вызванных экспансией микросателлитных повторов (СЦА 1, 2, 3, 6, 17 и болезнь Фридрейха) В дальнейшем необходимо проводить комплексное обследование пациентов для максимально полного описания фенотипа (ЭНМГ для верификации и характеристики полинейропатии, ЭМГ, УЗИ органов брюшной полости, биохимические маркеры и др.), после чего использовать таргетные мультигенные MPS-панели. Использование данного алгоритма позволит сократить время постановки диагноза и, в некоторых случаях, своевременно начать правильное лечение.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19−015−00171.